Þakka þér fyrir að heimsækja nature.com. Vafraútgáfan sem þú notar hefur takmarkaðan CSS-stuðning. Til að fá sem bestu upplifun mælum við með að þú notir nýjustu útgáfuna af vafranum (eða slökkvir á samhæfingarstillingu í Internet Explorer). Að auki, til að tryggja áframhaldandi stuðning, verður þessi síða laus við stíl og JavaScript.
Beinagrindarvöðvar eru ólíkgerð vefur sem aðallega samanstendur af vöðvaþráðum, sem hjá mönnum eru venjulega flokkaðir í þrjár gerðir: eina „hæga“ (gerð 1) og tvær „hraðar“ (gerðir 2A og 2X). Hins vegar er ólíkleiki milli og innan hefðbundinna vöðvaþráðagerða enn illa skilinn. Við beittu umritunar- og próteinfræðilegum aðferðum á 1050 og 1038 einstaka vöðvaþræði úr vastus lateralis manna, talið í sömu röð. Próteinfræðilega rannsóknin náði til karla og umritunarfræðilega rannsóknin náði til 10 karla og 2 kvenna. Auk þungkeðjuísóforma mýósíns greindum við efnaskiptaprótein, ríbósómprótein og frumutengingarprótein sem uppsprettur fjölvíddar breytileika milli vöðvaþráða. Ennfremur, þrátt fyrir að hafa borið kennsl á klasa af hægum og hraðvirkum trefjum, benda gögn okkar til þess að trefjar af gerð 2X séu svipgerðlega óaðgreinanlegar frá öðrum hraðkippandi trefjum. Ennfremur er flokkun byggð á þungkeðju mýósíns ófullnægjandi til að lýsa svipgerð vöðvaþráða í nemalínvöðvakvillum. Í heildina benda gögn okkar til fjölvíða ólíkleika vöðvaþráða, þar sem breytileiki nær lengra en ísóform þungakeðja mýósíns.
Frumuójöfnuður er eðlislægur eiginleiki allra líffræðilegra kerfa og gerir frumum kleift að sérhæfa sig til að mæta mismunandi þörfum vefja og frumna.1 Hefðbundin skoðun á ójöfnu beinagrindarvöðvaþráða hefur verið sú að hreyfitaugafrumur skilgreina trefjagerð innan hreyfieiningar og að trefjagerðin (þ.e. gerð 1, gerð 2A og gerð 2X hjá mönnum) er ákvörðuð af einkennum mýósínþungkeðju (MYH) ísóforma.2 Þetta var upphaflega byggt á óstöðugleika þeirra í pH ATPasa,3,4 og síðar á sameinda tjáningu þeirra á MYH.5 Hins vegar, með því að bera kennsl á og síðar viðurkenna „blandaða“ trefja sem tjá saman marga MYH í mismunandi hlutföllum, eru beinagrindarvöðvaþræðir í auknum mæli skoðaðir sem samfelldur hluti frekar en sem aðskildir trefjagerðir.6 Þrátt fyrir þetta treystir sviðið enn mikið á MYH sem aðalflokkara fyrir flokkun vöðvaþráða, skoðun sem líklega hefur áhrif á takmarkanir og verulega skekkju í fyrri rannsóknum á nagdýrum þar sem MYH tjáningarmynstur og úrval trefjagerða er frábrugðið því sem gerist hjá mönnum.2 Ástandið er enn flóknara vegna þess að mismunandi beinagrindarvöðvar manna sýna fjölbreytt úrval trefjagerða.7 Vastus lateralis er blandaður vöðvi með miðlungs (og því dæmigerða) MYH tjáningarsnið.7 Ennfremur gerir auðveld sýnataka hann að best rannsakaða vöðvanum í mönnum.
Því er óhlutdræg rannsókn á fjölbreytileika beinagrindarvöðvaþráða með því að nota öflug „ómics“ verkfæri mikilvæg en einnig krefjandi, að hluta til vegna fjölkjarna eðlis beinagrindarvöðvaþráða. Hins vegar hefur umritunar- og próteómics-tækni gjörbyltt næmi á undanförnum árum vegna ýmissa tækniframfara, sem gera kleift að greina beinagrindarvöðva í upplausn einstakra þráða. Fyrir vikið hafa orðið verulegar framfarir í að greina fjölbreytileika einstakra þráða og svörun þeirra við rýrnunaráreiti og öldrun. Mikilvægt er að þessar tækniframfarir hafa klíníska notkun, sem gerir kleift að greina ítarlegri og nákvæmari sjúkdómstengda truflun. Til dæmis er sjúkdómsfræði nemalínvöðvasjúkdómsins, eins algengasta erfðasjúkdómsins í vöðva (MIM 605355 og MIM 161800), flókin og ruglingsleg. Þess vegna gæti betri greining á truflunum á beinagrindarvöðvaþráðum leitt til verulegra framfara í skilningi okkar á þessum sjúkdómi.
Við þróuðum aðferðir til umritunar- og próteingreiningar á einstökum beinagrindarvöðvaþráðum sem voru handvirkt einangraðar úr vefjasýnum manna og beitum þeim á þúsundir trefja, sem gerði okkur kleift að rannsaka frumubreytileika beinagrindarvöðvaþráða manna. Í þessari vinnu sýndum við fram á kraft umritunar- og próteingreiningar á vöðvaþráðum og greindum efnaskipta-, ríbósóm- og frumutengingarprótein sem mikilvægar uppsprettur breytileika milli trefja. Ennfremur, með því að nota þetta próteingreiningarferli, greindum við klíníska þýðingu þráðormavöðvakvilla í einstökum beinagrindarvöðvaþráðum, sem leiddi í ljós samræmda breytingu í átt að óoxandi trefjum óháð trefjategund byggt á MyH.
Til að kanna fjölbreytileika beinagrindarvöðvaþráða manna þróuðum við tvö vinnuflæði til að gera kleift að greina umrit og prótein á einstökum beinagrindarvöðvaþráðum (Mynd 1A og Viðbótarmynd 1A). Við þróuðum og fínstilltum nokkur aðferðafræðileg skref, allt frá geymslu sýna og varðveislu RNA og próteinaheilleika til að hámarka afköst fyrir hverja aðferð. Fyrir umritgreiningu var þetta náð með því að setja inn sýnisértæk sameindastrikakóða í upphafsstig öfugrar umritunar, sem gerði kleift að sameina 96 þræði fyrir skilvirka vinnslu eftir á. Dýpri raðgreining (±1 milljón lestur á þráð) samanborið við hefðbundnar aðferðir með einstökum frumueiningum auðgaði enn frekar umritgögnin.21 Fyrir próteómfræði notuðum við stuttan litskiljunarhalla (21 mínútu) ásamt DIA-PASEF gagnaöflun á timsTOF massagreini til að hámarka dýpt próteómsins en viðhalda mikilli afköstum. 22,23 Til að kanna fjölbreytni heilbrigðra beinagrindarvöðvaþráða, greindum við umrit úr 1.050 einstökum þráðum frá 14 heilbrigðum fullorðnum gjöfum og prótein úr 1.038 þráðum frá 5 heilbrigðum fullorðnum gjöfum (viðbótartafla 1). Í þessari grein eru þessi gagnasöfn nefnd 1.000-þráða umrit og prótein, talið í sömu röð. Aðferð okkar greindi samtals 27.237 umrit og 2.983 prótein í 1.000-þráða umritunar- og próteingreiningunum (Mynd 1A, Viðbótargagnasöfn 1–2). Eftir að hafa síað umritunar- og próteingagnasöfnin fyrir >1.000 greind gen og 50% gild gildi á hverja þráð, voru síðari lífupplýsingagreiningar framkvæmdar fyrir 925 og 974 þræði í umrituninni og próteininu, talið í sömu röð. Eftir síun greindust að meðaltali 4257 ± 1557 gen og 2015 ± 234 prótein (meðaltal ± staðalfrávik) í hverri trefju, með takmörkuðum breytileika milli einstaklinga (viðbótarmyndir 1B–C, viðbótargagnasöfn 3–4). Hins vegar var breytileiki innan þátttakenda meiri hjá þátttakendum, líklega vegna mismunandi RNA/próteinframleiðslu milli trefja af mismunandi lengd og þversniðsflatarmáli. Fyrir flest prótein (>2000) var breytileikastuðullinn undir 20% (viðbótarmynd 1D). Báðar aðferðirnar gerðu kleift að fanga breitt breytilegt svið afrita og próteina með mjög tjáðum einkennum sem eru mikilvæg fyrir vöðvasamdrátt (t.d. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (viðbótarmyndir 1E–F). Flestir eiginleikar sem greindust voru sameiginlegir milli afritunar- og próteingagnasafnanna (viðbótarmynd 1G) og meðal UMI/LFQ styrkleiki þessara eiginleika var nokkuð vel tengdur (r = 0,52) (viðbótarmynd 1H).
Verkflæði í umritunar- og próteómfræði (búið til með BioRender.com). BD breytilegt sviðsferlar fyrir MYH7, MYH2 og MYH1 og útreiknuð þröskuld fyrir gerð trefja. E, F Dreifing MYH tjáningar yfir trefjar í umritunar- og próteómfræði gagnasöfnum. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP) línurit fyrir umritunar- og próteómfræði lituð eftir MYH-byggðri trefjategund. I, J Eiginleikalínurit sem sýna MYH7, MYH2 og MYH1 tjáningu í umritunar- og próteómfræði gagnasöfnum.
Við lögðum upphaflega af stað að úthluta MYH-byggðri trefjategund fyrir hverja trefjategund með því að nota fínstillta aðferð sem nýtir sér mikla næmni og kraftmikið svið MYH-tjáningar í omics gagnasöfnum. Fyrri rannsóknir hafa notað handahófskennd þröskuldmörk til að merkja trefjar sem hreinar gerð 1, gerð 2A, gerð 2X eða blandaðar byggt á föstu hlutfalli af tjáningu mismunandi MYH11,14,24. Við notuðum aðra aðferð þar sem tjáning hverrar trefjar var raðað eftir MYH sem við notuðum til að flokka trefjarnar: MYH7, MYH2 og MYH1, sem samsvara gerð 1, gerð 2A og gerð 2X trefjum, talið í sömu röð. Við reiknuðum síðan stærðfræðilega neðri beygjupunkt hverrar niðurstöðukúrfu og notuðum hann sem þröskuld til að úthluta trefjum sem jákvæðum (yfir þröskuldinum) eða neikvæðum (undir þröskuldinum) fyrir hverja MYH (Mynd 1B–D). Þessi gögn sýna að MYH7 (Mynd 1B) og MYH2 (Mynd 1C) hafa greinilegri kveikt/slökkt tjáningarprófíla á RNA stigi samanborið við prótein stig. Reyndar, á próteinstigi, voru mjög fáar trefjar sem ekki tjáðu MYH7, og engin trefja hafði 100% MYH2 tjáningu. Við notuðum næst fyrirfram ákveðin tjáningarmörk til að úthluta MYH-byggðum trefjategundum til allra trefja í hverju gagnasafni. Til dæmis voru MYH7+/MYH2-/MYH1- trefjar flokkaðar sem gerð 1, en MYH7-/MYH2+/MYH1+ trefjar voru flokkaðar sem blandaða gerð 2A/2X (sjá viðbótartöflu 2 fyrir ítarlega lýsingu). Með því að sameina allar trefjarnar sáum við merkilega svipaða dreifingu MYH-byggðra trefjategunda bæði á RNA stigi (mynd 1E) og prótein stigi (mynd 1F), en hlutfallsleg samsetning MYH-byggðra trefjategunda var mismunandi eftir einstaklingum, eins og búist var við (viðbótarmynd 2A). Flestar trefjar voru flokkaðar annað hvort sem hrein gerð 1 (34–35%) eða gerð 2A (36–38%), þó að einnig hafi verið greindur verulegur fjöldi blandaðra gerða 2A/2X trefja (16–19%). Áberandi munur er sá að hreinar trefjar af gerð 2X var aðeins hægt að greina á RNA-stigi, en ekki á próteinstigi, sem bendir til þess að hröð MYH-tjáning sé að minnsta kosti að hluta til stjórnuð eftir umritun.
Við staðfestum próteómfræðilega aðferð okkar til að greina MYH trefjar með því að nota mótefnavöðvagreiningu og báðar aðferðirnar náðu 100% samræmi við að bera kennsl á hreinar trefjar af gerð 1 og gerð 2A (sjá viðbótarmynd 2B). Hins vegar var próteómfræðilega aðferðin næmari og skilvirkari við að bera kennsl á blandaðar trefjar og magngreina hlutfall hvers MYH gens í hverjum trefjaþræði. Þessi gögn sýna fram á árangur þess að nota hlutlæga, mjög næma próteómfræðilega aðferð til að greina gerðir beinagrindarvöðvatrefja.
Við notuðum síðan samanlagðar upplýsingar úr umritunar- og próteinfræðigreiningum til að flokka vöðvaþræði á hlutlægan hátt út frá heildarumritunarfrumu þeirra eða próteinfrumu. Með því að nota UMAP-aðferðina (uniform manifold approximation and projection) til að minnka víddareiginleikann í sex meginþætti (viðbótarmyndir 3A–B) gátum við séð breytileika vöðvaþráða í umritunarfrumunni (mynd 1G) og próteinfrumunni (mynd 1H). Athyglisvert er að vöðvaþræðir voru ekki flokkaðir eftir þátttakendum (viðbótarmyndir 3C–D) eða prófunardögum (viðbótarmynd 3E) hvorki í umritunar- né próteinfræðigagnasöfnunum, sem bendir til þess að breytileiki innan þátttakenda í beinagrindarvöðvaþráðum sé meiri en breytileiki milli þátttakenda. Í UMAP-grafinum komu fram tveir aðskildir klasar sem tákna „hraðar“ og „hægar“ vöðvaþræðir (myndir 1G–H). MYH7+ (hægar) vöðvaþræðir voru hópaðar saman við jákvæða pól UMAP1, en MYH2+ og MYH1+ (hraðvirkar) vöðvaþræðir voru hópaðar saman við neikvæða pól UMAP1 (myndir 1I–J). Hins vegar var enginn greinarmunur gerður á milli hraðkippandi trefja (þ.e. gerð 2A, gerð 2X eða blandaðra 2A/2X) byggt á MYH tjáningu, sem bendir til þess að tjáning MYH1 (mynd 1I–J) eða annarra klassískra 2X vöðvaþráðamerkja eins og ACTN3 eða MYLK2 (viðbótarmyndir 4A–B) greini ekki á milli mismunandi vöðvaþráðagerða þegar allt umritið eða próteinið er skoðað. Ennfremur, samanborið við MYH2 og MYH7, voru fá umrit eða prótein jákvætt tengd MYH1 (viðbótarmyndir 4C–H), sem bendir til þess að fjöldi MYH1 endurspegli ekki að fullu umritið/próteinið í vöðvaþráðunum. Svipaðar niðurstöður komust að þegar blandaða tjáning þriggja MYH ísóforma var metin á UMAP stigi (viðbótarmyndir 4I–J). Þannig, þó að hægt sé að bera kennsl á 2X þræði á umritunarstigi eingöngu út frá magngreiningu MYH, eru MYH1+ þræðir ekki aðgreindir frá öðrum hraðþráðum þegar allt umritunarefnið eða próteinið er skoðað.
Sem upphafsrannsókn á ólíkleika hægra trefja umfram MYH, metum við fjögur þekkt prótein sem eru sértæk fyrir hæga trefjagerð: TPM3, TNNT1, MYL3 og ATP2A22. Undirgerðir hægra trefja sýndu háa, þó ekki fullkomna, Pearson fylgni við MYH7 bæði í afritunargreiningu (viðbótarmynd 5A) og próteingreiningu (viðbótarmynd 5B). Um það bil 25% og 33% af hægum trefjum voru ekki flokkaðar sem hreinar hægar trefjar af öllum gena-/próteinundirgerðum í afritunargreiningu (viðbótarmynd 5C) og próteingreiningu (viðbótarmynd 5D), talið í sömu röð. Því bætir flokkun hægra trefja byggð á mörgum gena-/próteinundirgerðum við aukna flækjustig, jafnvel fyrir prótein sem vitað er að eru sértæk fyrir trefjagerð. Þetta bendir til þess að flokkun trefja byggð á ísóformum einnar gena-/próteinfjölskyldu endurspegli ekki nægilega vel raunverulegan ólíkleika beinagrindarvöðvaþráða.
Til að kanna frekar breytileika í svipgerð beinagrindarvöðvaþráða manna á mælikvarða alls omics líkansins, framkvæmdum við óhlutdræga víddarlækkun gagnanna með því að nota aðalþáttagreiningu (PCA) (Mynd 2A). Líkt og með UMAP myndrit, höfðu hvorki þátttakandi né prófunardagur áhrif á þráðaþyrpingu á PCA stigi (viðbótarmyndir 6A–C). Í báðum gagnasöfnum var MYH-byggð trefjategund útskýrð með PC2, sem sýndi klasa af hægfara trefjum af gerð 1 og annan klasa sem innihélt hraðfara trefjar af gerð 2A, gerð 2X og blandaðar trefjar af gerð 2A/2X (Mynd 2A). Í báðum gagnasöfnum voru þessir tveir klasar tengdir saman með litlum fjölda af blönduðum trefjum af gerð 1/2A. Eins og búist var við staðfesti offramsetningargreining á helstu PC drifkraftunum að PC2 var knúið áfram af samdráttar- og efnaskiptaeinkennum (Mynd 2B og viðbótarmyndir 6D–E, viðbótargagnasöfn 5–6). Í heildina reyndist trefjagerð byggð á MYH nægja til að útskýra samfellda breytileika meðfram PC2, fyrir utan svokallaða 2X trefja sem voru dreifðar um umritið innan hraðþyrpingarinnar.
A. Aðalþáttagreiningarmyndir (PCA) af umritunar- og próteinfrumugögnum litaðar eftir trefjategund byggt á MYH. B. Auðgunargreining á umritunar- og próteindrifvökum í PC2 og PC1. Tölfræðileg greining var framkvæmd með því að nota clusterProfiler pakkann og Benjamini-Hochberg leiðréttum p-gildum. C, D. PCA myndrit lituð eftir millifrumuviðloðunargenaontology (GO) hugtökum í umritunar- og costamere GO hugtökum í próteinfrumunni. Örvar tákna umritunar- og próteindrifva og stefnur þeirra. E, F. Einföld margfalda nálgun og vörpun (UMAP) myndrit af klínískt mikilvægum eiginleikum sem sýna tjáningarhalla óháð hægum/hröðum trefjategundum. G, H. Tengsl milli PC2 og PC1 drifkrafta í umritunum og próteinfrumum.
Óvænt skýrði vöðvaþráðagerð byggð á MYH aðeins næst hæsta breytileikastigið (PC2), sem bendir til þess að aðrir líffræðilegir þættir sem ekki tengjast MYH-byggðri vöðvaþráðagerð (PC1) gegni mikilvægu hlutverki í stjórnun ólíkleika beinagrindarvöðvaþráða. Ofurfjölgunargreining á helstu drifkraftum í PC1 leiddi í ljós að breytileiki í PC1 var fyrst og fremst ákvarðaður af frumu-frumu viðloðun og ríbósóminnihaldi í umritsfrumunni, og kostamerum og ríbósómpróteinum í próteinfrumunni (Mynd 2B og viðbótarmyndir 6D–E, viðbótargagnasett 7). Í beinagrindarvöðvum tengja kostamerar Z-diskinn við sarkolemma og taka þátt í kraftflutningi og boðagjöf. 25 Skýrðar PCA-myndir með frumu-frumu viðloðun (umritsfrumur, mynd 2C) og kostamerum (próteinfrumur, mynd 2D) sýndu sterka vinstri hliðrun í PC1, sem bendir til þess að þessir eiginleikar séu auðgaðir í ákveðnum þráðum.
Ítarlegri rannsókn á vöðvaþráðaþyrpingum á UMAP-stigi leiddi í ljós að flestir eiginleikar sýndu MYH-byggðan tjáningarhalla sem var óháður vöðvaþráðagerð frekar en vöðvaþráðaundirþyrpingabundinn. Þessi samfella sást í nokkrum genum sem tengjast sjúklegum aðstæðum (Mynd 2E), svo sem CHCHD10 (taugavöðvasjúkdómur), SLIT3 (vöðvarýrnun), CTDNEP1 (vöðvasjúkdómur). Þessi samfella sást einnig í próteininu, þar á meðal próteinum sem tengjast taugasjúkdómum (UGDH), insúlínboðum (PHIP) og umritun (HIST1H2AB) (Mynd 2F). Samanlagt benda þessi gögn til samfellu í trefjagerðaóháðri hægum/hröðum kippummisleitni milli mismunandi vöðvaþráða.
Athyglisvert er að drifgen í PC2 sýndu góða fylgni milli umritunar-próteóms (r = 0,663) (Mynd 2G), sem bendir til þess að hægar og hraðkippandi trefjategundir, og sérstaklega samdráttar- og efnaskiptaeiginleikar beinagrindarvöðvaþráða, séu stjórnaðar af umritun. Hins vegar sýndu drifgen í PC1 enga fylgni milli umritunar-próteóms (r = -0,027) (Mynd 2H), sem bendir til þess að breytingar sem ekki tengjast hægum/hraðkippandi trefjategundir séu að mestu leyti stjórnaðar eftir umritun. Þar sem breytingar í PC1 voru fyrst og fremst útskýrðar með hugtökum í erfðafræði ríbósóma, og þar sem ríbósóm gegna mikilvægu og sérhæfðu hlutverki í frumunni með því að taka virkan þátt í og hafa áhrif á próteinþýðingu,31 lögðum við næst af stað til að rannsaka þessa óvæntu fjölbreytni í ríbósómum.
Við lituðum fyrst greiningarmynd próteómfræðinnar fyrir aðalþætti próteómfræðinnar eftir hlutfallslegum fjölda próteina í GOCC hugtakinu „cytoplasmic ribosome“ (mynd 3A). Þó að þetta hugtak sé auðgað á jákvæðu hliðinni á PC1, sem leiðir til lítils hallans, þá knýja ríbósómprótein skiptingu PC1 í báðar áttir (mynd 3A). Ríbósómprótein auðguð á neikvæðu hliðinni á PC1 voru meðal annars RPL18, RPS18 og RPS13 (mynd 3B), en RPL31, RPL35 og RPL38 (mynd 3C) voru helstu drifkraftarnir á jákvæðu hliðinni á PC1. Athyglisvert er að RPL38 og RPS13 voru mikið tjáð í beinagrindarvöðvum samanborið við aðra vefi (viðbótarmynd 7A). Þessi sérstöku ríbósómeinkenni í PC1 sáust ekki í umritunarfrumunni (viðbótarmynd 7B), sem bendir til stjórnunar eftir umritun.
A. Greiningarmynd af aðalþáttagreiningu (PCA) lituð samkvæmt genafræðilegri verufræði ríbósóma í umfrymi (GO) yfir próteinið. Örvar gefa til kynna stefnu próteinmiðlaðrar breytileika í PCA-myndinni. Línulengd samsvarar stigveldi aðalþátta fyrir tiltekið prótein. B, C. PCA eiginleikamyndrit fyrir RPS13 og RPL38. D. Óstýrð stigveldisgreining á ríbósómpróteinum í umfrymi. E. Byggingarlíkan af 80S ríbósóminu (PDB: 4V6X) sem sýnir fram á ríbósómprótein með mismunandi magni í beinagrindarvöðvaþráðum. F. Ríbósómprótein með mismunandi steikíómetríu staðsett nálægt mRNA útgangsrásinni.
Hugtökin ríbósómófleiðni og sérhæfing hafa verið sett fram áður, þar sem tilvist mismunandi ríbósómaundirhópa (ríbósómófleiðni) getur haft bein áhrif á próteinþýðingu í mismunandi vefjum32 og frumum33 í gegnum sértæka þýðingu á tilteknum mRNA umritunarlaugum34 (ríbósómsérhæfing). Til að bera kennsl á undirhópa ríbósómpróteina sem eru samframleidd í beinagrindarvöðvaþráðum, framkvæmdum við óstýrða stigveldisþyrpingargreiningu á ríbósómpróteinum í próteininu (Mynd 3D, Viðbótargagnasafn 8). Eins og búist var við flokkuðust ríbósómprótein ekki eftir trefjategund byggt á MYH. Hins vegar greindum við þrjá mismunandi klasa ríbósómpróteina; fyrsti klasinn (ribosomal_cluster_1) er samstýrður RPL38 og hefur því aukna tjáningu í trefjum með jákvæða PC1 prófíl. Annar klasinn (ribosomal_cluster_2) er samstýrður RPS13 og er hækkaður í trefjum með neikvæða PC1 prófíl. Þriðji klasinn (ribosoma_cluster_3) sýnir ekki samhæfða mismunandi tjáningu í beinagrindarvöðvaþráðum og má líta á hann sem „kjarna“ ríbósómprótein beinagrindarvöðva. Bæði ríbósómklasar 1 og 2 innihalda ríbósómprótein sem áður hefur verið sýnt fram á að stjórna annarri þýðingu (t.d. RPL10A, RPL38, RPS19 og RPS25) og hafa áhrif á þroska (t.d. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 Í samræmi við niðurstöður PCA sýndi ólík framsetning þessara ríbósómpróteina sem sást yfir þræðina einnig samfellu (viðbótarmynd 7C).
Til að sjá staðsetningu ólíkra ríbósómpróteina innan ríbósómsins notuðum við byggingarlíkan af 80S ríbósómi manna (Protein Data Bank: 4V6X) (Mynd 3E). Eftir að hafa einangrað ríbósómprótein sem tilheyrðu mismunandi ríbósómklösum voru staðsetningar þeirra ekki nákvæmlega samræmdar, sem bendir til þess að aðferð okkar hafi ekki veitt auðgun fyrir ákveðin svæði/brot ríbósómsins. Athyglisvert er þó að hlutfall stórra undireiningapróteina í klasa 2 var lægra en í klasa 1 og 3 (Viðbótarmynd 7D). Við sáum að prótein með breyttri steikíómetríu í beinagrindarvöðvaþráðum voru aðallega staðsett á yfirborði ríbósómsins (Mynd 3E), sem samræmist getu þeirra til að hafa samskipti við innri ríbósóm inngangsstað (IRES) frumefni í mismunandi mRNA stofnum og þannig samhæfa sértæka þýðingu. 40, 41 Ennfremur voru mörg prótein með breyttri steikíómetríu í beinagrindarvöðvaþráðum staðsett nálægt virkum svæðum eins og mRNA útgangsgöngunum (Mynd 3F), sem stjórna sértækt þýðingarlengingu og stöðvun ákveðinna peptíða. 42 Í stuttu máli benda gögn okkar til þess að steikíómetra próteina í beinagrindarvöðvum sýni ólíkleika, sem leiðir til mismunar á milli beinagrindarvöðvaþráða.
Næst ákváðum við að bera kennsl á einkennum hraðra og hægra kippþráða og kanna ferla sem stjórna umritun þeirra. Með því að bera saman klasa hraðra og hægra kippþráða sem skilgreindir eru með UMAP í gagnasöfnunum tveimur (myndir 1G–H og 4A–B), komu í ljós umritunar- og próteingreiningar 1366 og 804 mismunandi fjölbreytni eiginleika, talið í sömu röð (myndir 4A–B, viðbótargagnasöfn 9–12). Við sáum væntanlegan mun á einkennum sem tengdust sarkómerum (t.d. trópómýósíni og trópóníni), örvunar-samdráttartengingu (SERCA ísóform) og orkuefnaskiptum (t.d. ALDOA og CKB). Ennfremur voru umrit og prótein sem stjórna prótein ubikvítíneringu mismunandi tjáð í hraðra og hægra kippþráðum (t.d. USP54, SH3RF2, USP28 og USP48) (myndir 4A–B). Þar að auki var örverupróteingenið RP11-451G4.2 (DWORF), sem áður hefur verið sýnt fram á að er mismunandi tjáð á milli lambahryggþráðagerða43 og eykur SERCA virkni í hjartavöðva44, verulega uppstýrt í hægum beinagrindarvöðvaþráðum (Mynd 4A). Á sama hátt, á einstökum þráðum, sást marktækur munur á þekktum einkennum eins og efnaskiptatengdum laktat dehýdrógenasa ísóformum (LDHA og LDHB, Mynd 4C og Viðbótarmynd 8A)45,46 sem og áður óþekktum trefjategundasértækum einkennum (eins og IRX3, USP54, USP28 og DPYSL3) (Mynd 4C). Það var marktæk skörun á mismunandi tjáðum eiginleikum milli umritunar- og próteómgagnasettanna (Viðbótarmynd 8B), sem og fylgni milli margföldunarbreytinga sem aðallega var knúin áfram af meiri mismunandi tjáningu á eiginleikum sarkómera (Viðbótarmynd 8C). Athyglisvert er að sumar einkennurnar (t.d. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) sýndu sterka stjórnun eftir umritun aðeins á próteinstigi og höfðu hæga/hraða tjáningarferla sem voru sértækir fyrir trefjagerðina (viðbótarmynd 8C).
A og B eldfjallamyndir sem bera saman hæga og hraða klasa sem greindir eru með UMAP myndum (uniform manifold approximation and projection) á myndum 1G–H. Litaðir punktar tákna umrit eða prótein sem eru marktækt ólík við FDR < 0,05, og dekkri punktar tákna umrit eða prótein sem eru marktækt ólík við log breytingu > 1. Tvíhliða tölfræðileg greining var framkvæmd með DESeq2 Wald prófinu með Benjamini-Hochberg leiðréttum p-gildum (umritunargreining) eða Limma línulega líkaninu með empirískri Bayesískri greiningu og síðan Benjamini-Hochberg leiðréttingu fyrir margfalda samanburði (próteingreining). C Undirskriftarmyndir af völdum mismunandi tjáðum genum eða próteinum milli hægra og hraðra trefja. D Auðgunargreining á marktækt mismunandi tjáðum umritum og próteinum. Skarast gildi eru auðguð í báðum gagnasöfnum, umritunargildi eru aðeins auðguð í umritunarefninu og próteingildi eru aðeins auðguð í próteinefninu. Tölfræðileg greining var framkvæmd með clusterProfiler pakkanum með Benjamini-Hochberg leiðréttum p-gildum. E. Umritunarþættir sem eru sértækir fyrir trefjagerðir greindir með SCENIC byggðum á sértæknistigum stjórnenda sem fengnir eru með SCENIC og mismunandi mRNA tjáningu milli trefjagerða. F. Prófíll á völdum umritunarþáttum sem eru mismunandi tjáðir milli hægra og hraðra trefja.
Við framkvæmdum síðan offramsetningargreiningu á mismunandi framsettum genum og próteinum (Mynd 4D, Viðbótargagnasafn 13). Auðgun á ferlum fyrir eiginleika sem voru ólíkir milli gagnasafnanna tveggja leiddi í ljós væntanlegan mun, svo sem fitusýru-β-oxun og ketónefnaskiptaferli (hægar trefjar), vöðvaþráða-/vöðvasamdrátt (hraðþræðir og hægar trefjar, talið í sömu röð) og kolvetnabrotsferli (hraðþræðir). Virkni seríns/þreóníns próteinfosfatasa jókst einnig í hraðþráðum, knúin áfram af eiginleikum eins og stjórnunar- og hvatafosfatasaeiningum (PPP3CB, PPP1R3D og PPP1R3A), sem vitað er að stjórna glýkógenefnaskiptum (47) (Viðbótarmyndir 8D–E). Aðrar leiðir sem voru auðgaðar með hraðþráðum voru meðal annars vinnsluefni (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) í próteinfrumunni (viðbótarmynd 8F), sem hugsanlega taka þátt í stjórnun eftir umritun (48), og umritunarþáttavirkni (SREBF1, RXRG, RORA) í umritunarfrumunni (viðbótarmynd 8G). Hægar þræðir voru auðgaðar með oxídóredúktasa virkni (BDH1, DCXR, TXN2) (viðbótarmynd 8H), amíðbindingu (CPTP, PFDN2, CRYAB) (viðbótarmynd 8I), utanfrumuefni (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (viðbótarmynd 8J) og viðtaka-lígand virkni (FNDC5, SPX, NENF) (viðbótarmynd 8K).
Til að fá frekari innsýn í umritunarstjórnun sem liggur að baki einkennum hægra/hraða vöðvaþráða, framkvæmdum við greiningu á umritunarþáttum með því að nota SCENIC49 (viðbótargagnasett 14). Margir umritunarþættir voru marktækt auðgaðir milli hraðra og hægra vöðvaþráða (mynd 4E). Þetta voru meðal annars umritunarþættir eins og MAFA, sem hefur áður verið tengdur við hraðan þroska vöðvaþráða,50 sem og nokkrir umritunarþættir sem ekki höfðu áður verið tengdir við vöðvaþráðagerðasértæk gen. Meðal þeirra voru PITX1, EGR1 og MYF6 auðguðust umritunarþættirnir í hraðvirkum vöðvaþráðum (mynd 4E). Aftur á móti voru ZSCAN30 og EPAS1 (einnig þekkt sem HIF2A) auðguðust umritunarþættirnir í hægum vöðvaþráðum (mynd 4E). Í samræmi við þetta var MAFA tjáð á hærra stigi í UMAP svæðinu sem samsvarar hraðvirkum vöðvaþráðum, en EPAS1 hafði gagnstæða tjáningarmynstur (mynd 4F).
Auk þekktra prótein-kóðandi gena eru fjölmargar ókóðandi RNA lífgerðir sem gætu átt þátt í stjórnun á þroska og sjúkdómum hjá mönnum. 51, 52 Í umritunargagnasöfnum sýna nokkur ókóðandi RNA trefjagerðarsértækni (Mynd 5A og viðbótargagnasafn 15), þar á meðal LINC01405, sem er mjög sértækt fyrir hægar trefjar og er greint frá því að vera minna í vöðvum sjúklinga með hvatberavöðvakvilla. 53 Aftur á móti sýnir RP11-255P5.3, sem samsvarar lnc-ERCC5-5 geninu (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, hraða trefjagerðarsértækni. Bæði LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) og RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) sýna sértækni gagnvart beinagrindarvöðvum (viðbótarmyndir 9A–B) og hafa engin þekkt samdráttargen innan 1 Mb erfðamengishverfis síns, sem bendir til þess að þau gegni sérhæfðu hlutverki í stjórnun trefjategunda frekar en að stjórna nálægum samdráttargenum. Hægar/hraðar trefjategunda-sértækar tjáningarmynstur LINC01405 og RP11-255P5.3, talið í sömu röð, voru staðfest með RNAscope (myndir 5B–C).
A. Ókóðandi RNA umrit eru marktækt stjórnuð í hægum og hraðkippandi vöðvaþráðum. B. Dæmigerðar myndir úr RNAscope sem sýna sértækni LINC01405 og RP11-255P5.3 fyrir hæga og hraðkippandi vöðvaþræði, talið í sömu röð. Kvarðastika = 50 μm. C. Magnbundin ákvörðun á vöðvaþráða-sértækri ókóðandi RNA tjáningu eins og ákvörðuð var með RNAscope (n = 3 vefjasýni frá óháðum einstaklingum, þar sem hraðar og hægar vöðvaþræðir eru bornir saman innan hvers einstaklings). Tölfræðileg greining var framkvæmd með tvíhliða Student's t-prófi. Kassamyndir sýna miðgildi og fyrsta og þriðja fjórðung, þar sem vísbendingar benda á lágmarks- og hámarksgildi. D. De novo verkflæði til að bera kennsl á örveruprótein (búið til með BioRender.com). E. Örverupróteinið LINC01405_ORF408:17441:17358 er sérstaklega tjáð í hægum beinagrindarvöðvaþráðum (n = 5 vefjasýni frá óháðum þátttakendum, þar sem hraðar og hægar vöðvaþræðir eru bornir saman í hverjum þátttakanda). Tölfræðileg greining var framkvæmd með línulegri líkansaðferð Limm ásamt empirískri Bayesískri nálgun, og síðan með Benjamini-Hochberg aðferðinni fyrir margfalda samanburði með p-gildisleiðréttingu. Kassamyndir sýna miðgildi, fyrsta og þriðja fjórðung, þar sem vísbendingar benda á hámarks-/lágmarksgildi.
Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að margar hugsanlegar ókóðandi umritanir kóða fyrir umrituðum örverupróteinum, en sum þeirra stjórna vöðvastarfsemi. 44, 55 Til að bera kennsl á örveruprótein með hugsanlega sértækni fyrir trefjagerðir leituðum við í gagnagrunni okkar með 1000 trefjapróteinum með því að nota sérsniðna FASTA skrá sem innihélt raðir ókóðandi umrita (n = 305) sem fundust í gagnagrunninum með 1000 trefjum (mynd 5D). Við greindum 197 örveruprótein úr 22 mismunandi umritum, þar af voru 71 mismunandi stjórnað milli hægra og hraðra beinagrindarvöðvaþráða (viðbótarmynd 9C og viðbótargagnasett 16). Fyrir LINC01405 voru þrjár örverupróteinafurðir greindar, þar af ein sýndi svipaða sértækni fyrir hæga trefja og umritið (mynd 5E og viðbótarmynd 9D). Þannig greindum við LINC01405 sem gen sem kóðar fyrir örverupróteini sem er sértækt fyrir hæga beinagrindarvöðvaþræði.
Við þróuðum alhliða vinnuflæði fyrir stórfellda próteómgreiningu einstakra vöðvaþráða og greindum stjórnendur á ólíkleika trefja í heilbrigðum einstaklingum. Við notuðum þetta vinnuflæði til að skilja hvernig nemalínvöðvasjúkdómar hafa áhrif á ólíkleika beinagrindarvöðvaþráða. Nemalínvöðvasjúkdómar eru arfgengir vöðvasjúkdómar sem valda vöðvaslappleika og hjá börnum sem þjást af þeim koma fram með ýmsum fylgikvillum, þar á meðal öndunarerfiðleikum, hryggskekkju og takmörkuðum hreyfigetu útlima.19,20 Venjulega, í nemalínvöðvasjúkdómum, leiða sjúkdómsvaldandi afbrigði í genum eins og aktín alfa 1 (ACTA1) til yfirgnæfandi hægfara vöðvaþráðasamsetningu, þó að þessi áhrif séu ólík. Ein athyglisverð undantekning er troponín T1 nemalínvöðvasjúkdómur (TNNT1), sem hefur yfirgnæfandi fjölda hraðra trefja. Þannig gæti betri skilningur á ólíkleikanum sem liggur að baki röskun á beinagrindarvöðvaþráðum sem sést í nemalínvöðvasjúkdómum hjálpað til við að skýra flókið samband milli þessara sjúkdóma og vöðvaþráðagerðar.
Í samanburði við heilbrigða samanburðarhópa (n=3 í hverjum hópi) sýndu vöðvaþræðir sem einangraðir voru úr sjúklingum með nemalínvöðvasjúkdóm með stökkbreytingar í ACTA1 og TNNT1 genum greinilega vöðvarýrnun eða rýrnun (Mynd 6A, Viðbótartafla 3). Þetta olli verulegum tæknilegum áskorunum fyrir próteingreiningu vegna takmarkaðs magns af tiltæku efni. Þrátt fyrir þetta gátum við greint 2485 prótein í 272 beinagrindarvöðvaþráðum. Eftir síun fyrir að minnsta kosti 1000 magngreind prótein á hverja trefju voru 250 trefjar gerðar á lífupplýsingagreiningu. Eftir síun voru að meðaltali 1573 ± 359 prótein á hverja trefju magngreind (Viðbótarmynd 10A, Viðbótargagnasöfn 17–18). Athyglisvert er að þrátt fyrir verulega minnkun á trefjastærð minnkaði próteindýpt sýna sjúklinga með nemalínvöðvasjúkdóm aðeins lítillega. Þar að auki gerði vinnsla þessara gagna með okkar eigin FASTA skrám (þar á meðal ókóðandi umritum) okkur kleift að bera kennsl á fimm örveruprótein í beinagrindarvöðvaþráðum sjúklinga með nemalínvöðvasjúkdóm (viðbótargagnasafn 19). Virknisvið próteinsins var marktækt breiðara og heildarprótein í samanburðarhópnum samræmdust vel niðurstöðum fyrri greiningar á 1000 próteinþráðum (viðbótarmynd 10B–C).
A. Smásjármyndir sem sýna rýrnun eða rýrnun trefja og yfirgnæfandi fjölda mismunandi trefjagerða byggt á MYH í ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvasjúkdómum (NM). Kvarðastika = 100 μm. Til að tryggja endurtekningarhæfni litunar hjá sjúklingum með ACTA1 og TNNT1 voru þrjú sjúklingavef lituð tvisvar til þrisvar sinnum (fjórar sneiðar í hverju tilfelli) áður en dæmigerðar myndir voru valdar. B. Hlutföll trefjagerða hjá þátttakendum byggt á MYH. C. Aðalþáttagreining (PCA) á beinagrindarvöðvaþráðum hjá sjúklingum með nemalínvöðvasjúkdóma og samanburðarhópi. D. Beinagrindarvöðvaþræðir frá sjúklingum með nemalínvöðvasjúkdóma og samanburðarhópi varpaðir á PCA-mynd ákvarðað út frá 1000 trefjum sem greindar voru á mynd 2. Til dæmis, eldfjallamyndir sem bera saman muninn á þátttakendum með ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvasjúkdóma og samanburðarhópi, og á milli þátttakenda með ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvasjúkdóma. Litaðir hringir tákna prótein sem voru marktækt ólík við π < 0,05, og dökkir punktar tákna prótein sem voru marktækt ólík við FDR < 0,05. Tölfræðileg greining var framkvæmd með Limma línulega líkaninu og empirískum Bayesískum aðferðum, og síðan p-gildi leiðrétt fyrir margfalda samanburði með Benjamini-Hochberg aðferðinni. H. Auðgunargreining á marktækt mismunandi tjáðum próteinum yfir allt próteinið og í trefjum af gerð 1 og 2A. Tölfræðileg greining var framkvæmd með clusterProfiler pakkanum og Benjamini-Hochberg leiðréttum p-gildum. I, J. Aðalþáttagreiningarmyndir (PCA) litaðar eftir utanfrumuefni og hvatbera genaontologi (GO) hugtökum.
Þar sem nemalínvöðvakvillar geta haft áhrif á hlutfall MYH-tjáandi vöðvaþráða í beinagrindarvöðvum,19,20 skoðuðum við fyrst MYH-tjáandi vöðvaþráðagerðir hjá sjúklingum með nemalínvöðvakvilla og samanburðarhópi. Við ákvörðuðum vöðvaþráðagerð með því að nota óhlutdræga aðferð sem áður hefur verið lýst fyrir 1000 vöðvaþráðaprófið (viðbótarmyndir 10D–E) og aftur mistókst okkur að bera kennsl á hreinar 2X vöðvaþræðir (mynd 6B). Við sáum ólík áhrif nemalínvöðvakvilla á vöðvaþráðagerð, þar sem tveir sjúklingar með ACTA1 stökkbreytingar höfðu aukið hlutfall af tegund 1 vöðvaþráða, en tveir sjúklingar með TNNT1 nemalínvöðvakvilla höfðu minnkað hlutfall af tegund 1 vöðvaþráða (mynd 6B). Vissulega minnkaði tjáning MYH2 og hraðra troponín ísóforma (TNNC2, TNNI2 og TNNT3) í ACTA1-nemalín vöðvakvilla, en tjáning MYH7 minnkaði í TNNT1-nemalín vöðvakvilla (viðbótarmynd 11A). Þetta er í samræmi við fyrri skýrslur um mismunandi vöðvaþráðaskipti í nemalín vöðvakvilla.19,20 Við staðfestum þessar niðurstöður með ónæmisvefjaefnafræði og komumst að því að sjúklingar með ACTA1-nemalín vöðvakvilla höfðu yfirgnæfandi fjölda vöðvaþráða af gerð 1, en sjúklingar með TNNT1-nemalín vöðvakvilla höfðu gagnstæða mynstur (mynd 6A).
Á stigi eins trefja próteinsins flokkuðust beinagrindarvöðvaþræðir frá sjúklingum með ACTA1 og TNNT1 nemalín vöðvakvilla saman við meirihluta samanburðartrefjanna, þar sem TNNT1 nemalín vöðvakvillaþræðir voru almennt verst fyrir áhrifum (mynd 6C). Þetta var sérstaklega áberandi þegar teiknuð voru aðalþáttagreiningarmynd (PCA) af sýndaruppblásnum þráðum fyrir hvern sjúkling, þar sem sjúklingar 2 og 3 með TNNT1 nemalín vöðvakvilla virtust vera fjærst samanburðarsýnunum (viðbótarmynd 11B, viðbótargagnasett 20). Til að skilja betur hvernig trefjar frá sjúklingum með vöðvakvilla bera sig saman við heilbrigðar trefjar, notuðum við ítarlegar upplýsingar sem fengust úr próteingreiningu á 1.000 trefjum frá heilbrigðum fullorðnum þátttakendum. Við vörpuðum trefjum úr vöðvakvillagagnasettinu (sjúklingar með ACTA1 og TNNT1 nemalín vöðvakvilla og samanburðarhópur) yfir á PCA myndritið sem fékkst úr próteingreiningunni með 1000 trefjum (mynd 6D). Dreifing MYH trefjategunda meðfram PC2 í samanburðarþráðum var svipuð og dreifing trefjanna sem fékkst úr próteingreiningunni með 1000 trefjum. Hins vegar færðust flestar trefjar hjá sjúklingum með nemalínvöðvasjúkdóm niður PC2 og sköruðust við heilbrigðar hraðkippandi þræði, óháð upprunalegri MYH trefjategund þeirra. Þannig, þó að sjúklingar með ACTA1 nemalínvöðvasjúkdóm sýndu færslu í átt að tegund 1 trefjum þegar þeir voru magngreindir með MYH-byggðum aðferðum, þá færðu bæði ACTA1 nemalínvöðvasjúkdómur og TNNT1 nemalínvöðvasjúkdómur próteinið í beinagrindarvöðvaþráðunum í átt að hraðkippandi þráðum.
Við bárum síðan beint saman hvern sjúklingahóp við heilbrigðan samanburðarhóp og greindum 256 og 552 mismunandi tjáð prótein í ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvakvillum, talið í sömu röð (Mynd 6E–G og viðbótarmynd 11C, viðbótargagnasafn 21). Genauðgunargreining leiddi í ljós samræmda fækkun hvatberapróteina (Mynd 6H–I, viðbótargagnasafn 22). Óvænt var að þrátt fyrir mismunandi yfirgnæfandi fjölda trefjategunda í ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvakvillum, var þessi fækkun algjörlega óháð MYH-byggðri trefjategund (Mynd 6H og viðbótarmyndir 11D–I, viðbótargagnasafn 23). Þrjú örveruprótein voru einnig stjórnað í ACTA1 eða TNNT1 nemalínvöðvakvillum. Tvö af þessum örpróteinum, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (einnig þekkt sem LINC00598 eða Lnc-FOXO1) og ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), sýndu aðeins mismunandi magn í vöðvaþráðum af tegund 1. Áður hefur verið greint frá því að ENSG00000215483_TR14_ORF67 gegni hlutverki í stjórnun frumuhrings.56 Hins vegar var ENSG00000232046_TR1_ORF437 (samsvarandi LINC01798) aukið í bæði vöðvaþráðum af tegund 1 og tegund 2A í ACTA1-nemalín vöðvakvilla samanborið við heilbrigðan samanburðarhóp (Viðbótarmynd 12A, Viðbótargagnasafn 24). Aftur á móti voru ríbósómprótein að mestu óbreytt af nemalínvöðvasjúkdómi, þó að RPS17 væri niðurstýrt í ACTA1 nemalínvöðvasjúkdómi (Mynd 6E).
Auðgunargreining leiddi einnig í ljós uppstýringu á ferlum ónæmiskerfisins í ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvakvillum, en frumuviðloðun jókst einnig í TNNT1 nemalínvöðvakvilla (mynd 6H). Auðgun þessara utanfrumuþátta endurspeglaðist í því að utanfrumuefnispróteinin færðu PCA í PC1 og PC2 í neikvæða átt (þ.e. í átt að þeim trefjum sem eru mest fyrir áhrifum) (mynd 6J). Báðir sjúklingahópar sýndu aukna tjáningu utanfrumupróteina sem taka þátt í ónæmissvörun og viðgerðarferlum á sarkólemma, svo sem annexínum (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 og samverkandi próteini þeirra S100A1159 (viðbótarmyndir 12B–C). Áður hefur verið greint frá því að þetta ferli sé aukið í vöðvarýrnun60 en okkur vitandi hefur það ekki áður verið tengt nemalínvöðvakvillum. Eðlileg virkni þessa sameindakerfis er nauðsynleg fyrir viðgerðir á sarkólemma eftir meiðsli og fyrir samruna nýmyndaðra vöðvafrumna við vöðvatrefjar58,61. Þannig bendir aukin virkni þessa ferlis í báðum sjúklingahópum til viðgerðarviðbragða við meiðslum af völdum óstöðugleika í vöðvaþráðum.
Áhrif hvorrar nemalínvöðvakvilla fyrir sig voru vel tengd (r = 0,736) og sýndu sanngjarna skörun (viðbótarmyndir 11A–B), sem bendir til þess að ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvakvilli hafi svipuð áhrif á próteinið. Hins vegar voru sum prótein aðeins stjórnuð í ACTA1 eða TNNT1 nemalínvöðvakvilla (viðbótarmyndir 11A og C). Fibrotíska próteinið MFAP4 var eitt af mest uppstýrðu próteinunum í TNNT1 nemalínvöðvakvilla en var óbreytt í ACTA1 nemalínvöðvakvilla. SKIC8, hluti af PAF1C fléttunni sem ber ábyrgð á stjórnun HOX genatjáningar, var niðurstýrt í TNNT1 nemalínvöðvakvilla en ekki fyrir áhrifum í ACTA1 nemalínvöðvakvilla (viðbótarmynd 11A). Bein samanburður á ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvakvilla leiddi í ljós meiri fækkun hvatberapróteina og aukningu á ónæmiskerfispróteinum í TNNT1 nemalínvöðvakvilla (mynd 6G–H og viðbótarmyndir 11C og 11H–I). Þessar upplýsingar eru í samræmi við meiri rýrnun/rýrnun sem sést í TNNT1 nemalínvöðvakvilla samanborið við TNNT1 nemalínvöðvakvilla (mynd 6A), sem bendir til þess að TNNT1 nemalínvöðvakvilli sé alvarlegri mynd sjúkdómsins.
Til að meta hvort áhrif nemalínvöðvakvilla sem komu fram haldist viðvarandi á öllum vöðvanum, framkvæmdum við próteingreiningu á vöðvasýnum úr sama hópi sjúklinga með TNNT1 nemalínvöðvakvilla og bárum þá saman við samanburðarhóp (n = 3 í hverjum hópi) (Viðbótarmynd 13A, Viðbótargagnasafn 25). Eins og búist var við voru samanburðarhópar nátengdir í aðalþáttagreiningunni, en sjúklingar með TNNT1 nemalínvöðvakvilla sýndu meiri breytileika milli sýna, svipaðan og sást í greiningu á einstökum trefjum (Viðbótarmynd 13B). Magngreining endurskapaði mismunandi tjáð prótein (Viðbótarmynd 13C, Viðbótargagnasafn 26) og líffræðileg ferli (Viðbótarmynd 13D, Viðbótargagnasafn 27) sem voru auðkennd með því að bera saman einstakar trefjar, en glataði getunni til að greina á milli mismunandi trefjategunda og tókst ekki að taka tillit til ólíkra sjúkdómsáhrifa milli trefja.
Samanlagt sýna þessi gögn að próteómfræði stakra vöðvaþráða getur varpað ljósi á klíníska líffræðilega eiginleika sem ekki er hægt að greina með markvissum aðferðum eins og ónæmisþráðablokkun. Ennfremur varpa þessi gögn ljósi á takmarkanir þess að nota aktínþráðagreiningu (MYH) eina sér til að lýsa aðlögun að svipgerð. Reyndar, þó að trefjategundarskipti séu mismunandi eftir aktín- og trópónín nemalínvöðvasjúkdómum, þá aftengja báðir nemalínvöðvasjúkdómarnir MYH trefjategundargreiningu frá efnaskiptum beinagrindarvöðvaþráða í átt að hraðari og minna oxandi vöðvapróteini.
Frumuójöfnuður er mikilvægur til þess að vefir geti mætt fjölbreyttum þörfum þeirra. Í beinagrindarvöðvum er þetta oft lýst sem trefjategundum sem einkennast af mismunandi kraftframleiðslu og þreytuhæfni. Hins vegar er ljóst að þetta skýrir aðeins lítinn hluta af breytileika beinagrindarvöðvaþráða, sem er mun breytilegri, flóknari og marghliða en áður var talið. Tækniframfarir hafa nú varpað ljósi á þá þætti sem stjórna beinagrindarvöðvaþráðum. Reyndar benda gögn okkar til þess að trefjar af gerð 2X séu hugsanlega ekki sérstök undirtegund beinagrindarvöðvaþráða. Ennfremur greindum við efnaskiptaprótein, ríbósómprótein og frumutengd prótein sem helstu ákvarðanaþætti ójöfnuðar beinagrindarvöðvaþráða. Með því að beita próteinfræðilegri vinnuflæði okkar á sjúklingasýni með þráðormavöðvasjúkdóm, sýndum við enn frekar fram á að MYH-byggð trefjategund endurspeglar ekki að fullu ójöfnuð beinagrindarvöðva, sérstaklega þegar kerfið er truflað. Reyndar, óháð MYH-byggðri trefjategund, leiðir þráðormavöðvasjúkdómur til breytinga í átt að hraðari og minna oxandi trefjum.
Beinagrindarvöðvaþræðir hafa verið flokkaðir frá 19. öld. Nýlegar omics greiningar hafa gert okkur kleift að byrja að skilja tjáningarferla mismunandi MYH þráðategunda og svörun þeirra við mismunandi áreitum. Eins og lýst er hér hafa omics aðferðir einnig þann kost að þær eru næmari fyrir magngreiningu trefjategundamerkja en hefðbundnar mótefnabundnar aðferðir, án þess að reiða sig á magngreiningu eins (eða fárra) merkja til að skilgreina beinagrindarvöðvaþráðategund. Við notuðum viðbótar umritunar- og próteinfræðileg vinnuflæði og samþættum niðurstöðurnar til að kanna umritunar- og eftir-umritunarstjórnun á trefjamisleitni í beinagrindarvöðvaþráðum manna. Þetta vinnuflæði leiddi til þess að ekki tókst að bera kennsl á hreinar 2X-gerð trefjar á próteinstigi í vastus lateralis hjá hópi okkar af heilbrigðum ungum körlum. Þetta er í samræmi við fyrri rannsóknir á einstökum trefjum sem fundu <1% hreinar 2X trefjar í heilbrigðum vastus lateralis, þó að þetta ætti að staðfestast í öðrum vöðvum í framtíðinni. Misræmið milli greiningar á næstum hreinum 2X trefjum á mRNA stigi og aðeins blandaðra 2A/2X trefja á próteinstigi er undarlegt. MYH ísóform mRNA tjáning er ekki daglega,67 sem bendir til þess að ólíklegt sé að við höfum „misst“ af upphafsmerki MYH2 í að því er virðist hreinum 2X þráðum á RNA stigi. Ein möguleg skýring, þótt hún sé eingöngu tilgáta, gæti verið munur á prótein- og/eða mRNA stöðugleika milli MYH ísóforma. Reyndar er engin hröð þráður 100% hreinn fyrir neitt MYH ísóform og það er óljóst hvort MYH1 mRNA tjáningarstig á bilinu 70–90% myndi leiða til jafns magns MYH1 og MYH2 á próteinstigi. Hins vegar, þegar allt umritið eða próteinið er skoðað, getur klasagreining með vissu aðeins greint tvo aðskilda klasa sem tákna hæga og hraða beinagrindarvöðvaþræði, óháð nákvæmri MYH samsetningu þeirra. Þetta er í samræmi við greiningar sem nota einkjarna umritunaraðferðir, sem venjulega bera aðeins kennsl á tvo aðskilda vöðvaklasa. 68, 69, 70 Þó fyrri próteinrannsóknir hafi bent á trefjar af gerð 2X, þá flokkast þessar trefjar ekki sérstaklega frá hinum hraðfleygu trefjunum og sýna aðeins lítinn fjölda mismunandi próteina samanborið við aðrar trefjategundir byggðar á MYH. 14 Þessar niðurstöður benda til þess að við ættum að snúa aftur til sjónarmiða frá fyrri hluta 20. aldar um flokkun vöðvaþráða, sem skipti beinagrindarvöðvaþráðum manna ekki í þrjá aðskilda flokka byggða á MYH, heldur í tvo klasa byggða á efnaskipta- og samdráttareiginleikum þeirra. 63
Mikilvægara er að skoða ætti ólíkleika vöðvaþráða á mörgum víddum. Fyrri rannsóknir á „ómík“ hafa bent í þessa átt og benda til þess að beinagrindarvöðvaþræðir myndi ekki aðskilda klasa heldur raðast eftir samfelldri röð. 11, 13, 14, 64, 71 Hér sýnum við fram á að auk mismunandi samdráttar- og efnaskiptaeiginleika beinagrindarvöðva er hægt að aðgreina vöðvaþræði með eiginleikum sem tengjast frumu- og frumuvíxlverkunum og þýðingarferlum. Reyndar fundum við ólíkleika ríbósóma í beinagrindarvöðvaþráðum sem stuðlar að ólíkleika óháð gerðum hægra og hraðra þráða. Undirliggjandi orsök þessarar miklu ólíkleika í vöðvaþráðum, óháð gerðum hægra og hraðra þráða, er enn óljós, en hún gæti bent til sérhæfðrar rúmfræðilegrar skipulagningar innan vöðvaþráða sem bregðast best við sérstökum kröftum og álagi, 72 sérhæfðra frumu- eða líffærasértækra samskipta við aðrar frumugerðir í vöðvaörumhverfinu 73,74,75 eða mismunandi ríbósómvirkni innan einstakra vöðvaþráða. Reyndar hefur verið sýnt fram á að ríbósóm-sameindaplasmía, annaðhvort með paralogous skiptingu á RPL3 og RPL3L eða á stigi 2′O-metýleringar á rRNA, tengist þykknun beinagrindarvöðva76,77. Fjölþátta- og rúmfræðileg notkun ásamt virkni einstakra vöðvaþráða mun enn frekar auka skilning okkar á vöðvalíffræði á fjölþátta stigi78.
Með því að greina prótein úr einstökum vöðvaþráðum frá sjúklingum með nemalínvöðvasjúkdóma sýndum við einnig fram á notagildi, árangur og notagildi próteingreiningar á einstökum vöðvaþráðum til að skýra klíníska sjúkdómsmyndun beinagrindarvöðva. Ennfremur, með því að bera saman vinnuflæði okkar við heildræna próteingreiningu, gátum við sýnt fram á að próteingreining á einstökum vöðvaþráðum gefur sömu dýpt upplýsinga og heildræn vefjapróteingreining og eykur þessa dýpt með því að taka tillit til ólíkleika milli trefja og gerð vöðvaþráða. Auk væntanlegs (þó breytilegs) munar á hlutfalli trefjagerða sem sést í ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvasjúkdómum samanborið við heilbrigðan samanburðarhóp,19 sáum við einnig oxunar- og utanfrumuendurgerð óháð MYH-miðlaðri gerðaskiptingu trefja. Bandvefsmyndun hefur áður verið tilkynnt í TNNT1 nemalínvöðvasjúkdómum.19 Hins vegar byggir greining okkar á þessari niðurstöðu með því að leiða einnig í ljós aukið magn utanfrumu seytingar á streitutengdum próteinum, svo sem annexínum, sem taka þátt í viðgerðarferlum sarcolemmal, í vöðvaþráðum frá sjúklingum með ACTA1 og TNNT1 nemalínvöðvasjúkdóma.57,58,59 Að lokum má segja að aukið annexínmagn í vöðvaþráðum frá sjúklingum með nemalínvöðvasjúkdóm gæti verið frumuviðbrögð við viðgerð á alvarlega rýrnuðum vöðvaþráðum.
Þó að þessi rannsókn sé stærsta greining á heildarvöðvaómík hjá mönnum til þessa, er hún ekki án takmarkana. Við einangruðum beinagrindarvöðvaþræði úr tiltölulega litlu og einsleitu úrtaki þátttakenda og einum vöðva (vastus lateralis). Því er ómögulegt að útiloka tilvist tiltekinna þráðahópa milli vöðvagerða og á öfgum vöðvalífeðlisfræðinnar. Til dæmis getum við ekki útilokað möguleikann á því að undirhópur af ofurhröðum þráðum (t.d. hreinum 2X þráðum) komi fram hjá mjög þjálfuðum spretthlaupurum og/eða styrktaríþróttamönnum79 eða á tímabilum vöðvaóvirkni66,80. Ennfremur kom takmarkað úrtaksstærð þátttakenda í veg fyrir að við gætum rannsakað kynjamun í ólíkleika þráða, þar sem vitað er að hlutföll trefjagerða eru mismunandi milli karla og kvenna. Ennfremur gátum við ekki framkvæmt umritunar- og próteinómgreiningar á sömu vöðvaþráðum eða sýnum frá sömu þátttakendum. Þar sem við og aðrir höldum áfram að hámarka greiningar á einfrumum og einum vöðvaþráðum með omics greiningu til að ná fram afar litlum sýnisinntaki (eins og sýnt er hér í greiningu á trefjum frá sjúklingum með hvatberavöðvakvilla), verður tækifærið til að sameina fjölómískar (og virknis) aðferðir innan einstakra vöðvaþráða augljóst.
Í heildina greina og útskýra gögn okkar umritunar- og eftirritunarþætti sem valda ólíkleika í beinagrindarvöðvum. Nánar tiltekið kynnum við gögn sem véfengja langvarandi trúarkenningu í lífeðlisfræði beinagrindarvöðva sem tengist klassískri skilgreiningu á trefjategundum sem byggir á MYH. Við vonumst til að endurnýja umræðuna og að lokum endurhugsa skilning okkar á flokkun og ólíkleika beinagrindarvöðvaþráða.
Fjórtán hvítir þátttakendur (12 karlar og 2 konur) samþykktu sjálfviljugir að taka þátt í þessari rannsókn. Rannsóknin var samþykkt af siðanefnd Háskólasjúkrahússins í Ghent (BC-10237), var í samræmi við Helsinki-yfirlýsinguna frá 2013 og var skráð á ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Almenn einkenni þátttakenda eru kynnt í viðbótartöflu 1. Eftir að hafa fengið munnlegt og skriflegt upplýst samþykki gengust þátttakendur undir læknisskoðun áður en þeir voru endanlega teknir inn í rannsóknina. Þátttakendur voru ungir (22–42 ára), heilbrigðir (engir sjúkdómar, engin reykingasaga) og miðlungs líkamlega virkir. Hámarks súrefnisupptaka var mæld með þrepaþjálfara til að meta líkamlegt ástand eins og áður hefur verið lýst. 81
Vöðvasýni voru tekin í hvíld og á fastandi maga þrisvar sinnum, með 14 daga millibili. Þar sem þessi sýni voru tekin sem hluti af stærri rannsókn, neyttu þátttakendur lyfleysu (laktósa), H1-viðtakablokka (540 mg fexófenadín) eða H2-viðtakablokka (40 mg famótidín) 40 mínútum fyrir vefjasýnið. Við höfum áður sýnt fram á að þessir histamínviðtakablokkar hafa ekki áhrif á hvíldarhæfni beinagrindarvöðva81 og engin ástandstengd þyrping sást í gæðaeftirlitsmyndum okkar (viðbótarmyndir 3 og 6). Staðlað mataræði (41,4 kcal/kg líkamsþyngdar, 5,1 g/kg líkamsþyngdar kolvetni, 1,4 g/kg líkamsþyngdar prótein og 1,6 g/kg líkamsþyngdar fita) var viðhaldið í 48 klukkustundir fyrir hvern tilraunadag og stöðluð morgunverður (1,5 g/kg líkamsþyngdar kolvetni) var neytt að morgni tilraunadagsins. Undir staðdeyfingu (0,5 ml af 1% lídókaíni án adrenalíns) voru vöðvasýni tekin úr vastus lateralis vöðvanum með húðsogi með Bergström.82 Vöðvasýni voru strax sett í RNAlater og geymd við 4°C þar til trefjarnar voru fjarlægðar handvirkt (í allt að 3 daga).
Nýeinangraðar vöðvaþráðaknippur voru fluttar yfir í ferskt RNAlater ræktunarmiðil í ræktunarskál. Einstakar vöðvaþræðir voru síðan krufðar handvirkt með víðómasjá og fínni pinsettu. Tuttugu og fimm þræðir voru krufðir úr hverri vefjasýni, með sérstakri áherslu á að velja trefjar frá mismunandi stöðum í vefjasýninu. Eftir krufningu var hverri þræði varlega dýft í 3 μl af lýsisbuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) sem innihélt próteinasa K og DNasa ensím til að fjarlægja óæskileg prótein og DNA. Frumulýsing og prótein/DNA fjarlæging var síðan hafin með stuttri vortexingu, snúningi vökvans í örskilvindu og ræktun við stofuhita (10 mínútur). Lýsiefnið var síðan ræktað í hitahringrásartæki (T100, Bio-Rad) við 37°C í 5 mínútur, 75°C í 5 mínútur og síðan geymt strax við -80°C þar til frekari vinnsla fór fram.
Illumina-samhæfð pólýadenýleruð RNA bókasöfn voru útbúin úr 2 µl af vöðvaþráðalýsat með því að nota QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Ítarlegar aðferðir er að finna í handbók framleiðanda. Ferlið hefst með myndun fyrsta þáttar cDNA með öfugri umritun, þar sem einstök sameindaauðkenni (UMI) og sýnisbundin i1 strikamerki eru sett inn til að tryggja safn sýna og draga úr tæknilegum breytileika við vinnslu eftir vinnslu. cDNA úr 96 vöðvaþráðum er síðan safnað saman og hreinsað með segulperlum, eftir það er RNA fjarlægt og myndun annars þáttar er framkvæmd með handahófskenndum praimerum. Bókasafnið er hreinsað með segulperlum, safnsbundnum i5/i7 merkjum er bætt við og PCR magnað. Síðasta hreinsunarskref framleiðir Illumina-samhæfð bókasöfn. Gæði hvers safns voru metin með því að nota High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Byggt á magngreiningu með Qubit voru söfnin síðan sett saman við jafnmólstyrk (2 nM). Safnið sem myndaðist var síðan raðgreint á NovaSeq 6000 tæki í stöðluðum ham með því að nota NovaSeq S2 hvarfefnissettið (1 × 100 núkleótíð) með 2 nM hleðslu (4% PhiX).
Gögnin okkar byggja á gagnagreiningarleiðbeiningum Lexogen fyrir QuantSeq Pool (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Gögnin voru fyrst afmargfölduð með bcl2fastq2 (v2.20.0) byggt á i7/i5 vísitölunni. Lestur 2 var síðan afmargfölduð með idemux (v0.1.6) byggt á strikamerkinu úr i1 sýninu og UMI raðir voru dregnar út með umi_tools (v1.0.1). Lestur var síðan snyrtur með cutadapt (v3.4) í mörgum umferðum til að fjarlægja stuttar lestur (<20 að lengd) eða lestur sem samanstóð eingöngu af millistykki. Lestur var síðan samstilltur við erfðamengi mannsins með því að nota STAR (v2.6.0c) og BAM skrár voru flokkaðar með SAMtools (v1.11). Tvöfaldar lestur voru fjarlægðar með því að nota umi_tools (v1.0.1). Að lokum var samstillingartalning framkvæmd með því að nota featureCounts í Subread (v2.0.3). Gæðaeftirlit var framkvæmt með FastQC (v0.11.9) á nokkrum millistigum ferlisins.
Öll frekari lífupplýsingavinnsla og sjónræn framsetning var framkvæmd í R (v4.2.3), aðallega með því að nota Seurat (v4.4.0) vinnuflæðið.83 Því voru einstök UMI gildi og lýsigagnafylki umbreytt í Seurat hluti. Gen sem tjáð voru í færri en 30% allra trefja voru fjarlægð. Lággæða sýni voru fjarlægð út frá lágmarksþröskuldi 1000 UMI gilda og 1000 greindra gena. Að lokum stóðust 925 trefjar öll gæðaeftirlitsskref. UMI gildi voru staðluð með Seurat SCTransform v2 aðferðinni,84 þar á meðal öll 7418 greind einkenni, og mismunur milli þátttakenda var útilokaður. Öll viðeigandi lýsigögn er að finna í viðbótargagnasafni 28.
Birtingartími: 10. september 2025